Овај текст представља сажети приказ рада објављеног у часопису Клиничка и експериментална имунологија (Clinical and Experimental Immunology) (новембар 2020; вол.202(2); 162‒192), од стране Трегонинга ( Ј.S. Tregoning) и сарадника а који је in extenso објављен ва сајту САНУ. Текст није дословни превод оригиналног текста већ одабир делова који су по мишљењу аутора овог текста (академика Миодрага Чолића) најзначајнији за разумевање основне структуре вируса, различитих платформи за креирање вакцина против SARS-CoV-2, предности и мана појединих платформи, питања ефикасности и безбедности вакцина развијених у рекордно кратком времену…

Вакцине против SARS-CoV-2

У стратегији борбе против инфекције КОВИД-19 највећи значај се придаје вакцинацији. Приступ креирању вакцина је различит, почев од традиционалног начина применом живих ослабљених вируса, инактивисаних (мртвих вируса), коришћењем протеина или делова протеина вируса, до нових приступа. Нови приступи, од којих се неки први пут користе и због тога изазивају посебну пажњу, укључују примену вирусних вектора и нуклеинских киселина. За било коју од наведених платформи два најважнија фактора су ефикасност и безбедност вакцина. Други проблем је како од развоја ефикасне вакцине у лабораторијским условима прећи на масовну производњу. У сваком случају, полазна разматрања почињу од адекватног избора антигена из палете антигена који су специфични за SARS-CoV-2 , а који имају највећи имуногени потенцијал да створе довољно ефикасан и дуготрајан колективни имунитет.

Први и најзначајнији каднидат је S протеин (Spike protein). Да је он најимуногенији, показала су ранија истраживања на SARS-CoV-1 . Неутралишућа антитела, која се стварају на S протеину, највише се везују за тзв. рецептор-везујући домен. Због тога се та секвенца антигена и користи у неким вакцинама у односу на цео S молекул. Врло је битно да S антиген у вакцинама задржи своју нативну структуру и у том циљу се користе различити поступци. N антиген је молекул нуклеокапсида вируса, који је такође врло имуноген, а антитела према њему имају дужи полуживот него антитела према S антигену. Постоји сумња да би у извесних особа вакцинисаних N протеином могле да се јаве нежељене реакције које су забележене код SARS-CoV-1. Са друге стране, недектабилност антитела према N антигену може бити корисно код вакцина које садрже S протеин. У стратегији избора најбољег антигена користе се и  пептидне секвенце које стимулишу ефикасан T ћелијски одговор.

За сваку врсту вакцине развијене су специфичне платформе. Детаљи се могу наћи на сајту https://vac‐lshtm.shinyapps.io/ncov_vaccine_landscape/, који обухвата податке сакупљене до септембра 2020. год. као и на вебсајту СЗО. С обзиром да многе фармацеутске компаније производе вакцине које се налазе у фази развоја, рецензиране публикације које се тичу њихових својстава и ефикасности ретко се објављују у потпуности, и због тога јавност о томе добија информације углавном из медија.

Протеинске вакцине

Протеинске вакцине се темеље на примени рекомбинантних протеина који су локализовани на површини вируса. По правилу, ове вакцине су сигурне али су слабо имуногене да створе довољан имунитет, због чега је неопходно да се примењују са супстанцама које повећавају имуногеност (адјуванси). Производња рекомбинантних протеина укључује различите рекомбинантне технике генетичког инжењерства, при чему се ген од интереса убацује у бактерије, ћелије сисара или модификоване ћелије биљака као што су ћелије дувана. Свака од ових технологија има предности и мана, али по правилу, пре коришћења протеина неопходна је његова модификација. Једна од протеинских вакцина у развоју јесте вакцина компаније Clover Biopharmaceuticals која користи ћелије сисара за производњу модификованог S протеина SARS-CoV-2 . Компанија Санофи (Sanofi S.A.) развија протеинску вакцину против SARS-CoV-2 коришћењем бацуловируса за експресију S протеина.

Вирусима сличне честице (VLP, Virus-like particle) представљају посебну подврсту протеинских вакцина. То су, у ствари, вештачки конструисане наночестице које подсећају на вирусе, а најчешће садрже доминантни протеин вируса или више протеина из омотача вируса. Протеини се, такође, производе једном од наведених рекомбинантних технологија. Неке од вакцина против SARS-CoV-2, које користе овакву платформу, јесу вакцине компаније Novavax која на VLP (NVX‐CoV2373) има инкорпориран S протеин а за производњу рекомбинантног S протеина користи бакуловирус којим се инфицирају ћелије инсеката за производњу вируса. Прелиминарна испитивања су показала да је вакцина имуногена, тј способна да створи имунитет, али се мора користити са адјувансом. Друга VLP вакцина је вакцина компаније Medicago (NCT04450004) која за експресију S протеина SARS-CoV-2 користи биљне ћелије дувана Nicotiana benthamiana. За адјувансе се користе секвенце нуклеинских киселина вируса, као сто су GpG олигонуклеотиди, које могу да покрену урођени имунитет.

Пептидне вакцине

Пептидне вакцине се базирају на примени само делова вирусних протеина за које је претходним истраживањима показано да су имуногени. Наиме, показано је да су у оквиру протеина само поједине пептидне секвенце имуногене и да могу да покрену имунски одговор који је посредован Т лимфоцитима. У оквиру SARS-CoV-2 идентификовано је више таквих пептидних секвенци и зато се покушава да се управо оне искористе за вакцину. Недостатак је што овакав приступ захтева додавање адјуванса у вакцину. Неке од мултипептидних вакцина, које су у поступку клиничких тестирања, јесу вакцине Covaxx (NCTO4545749) или Института „Вектор” (Vector Institute) (NCTO 4527575). Пептиди се користе и у комплексима са вештачким антиген-презентујућим ћелијама које имају наснажнију способност да стимулишу имунски одгвор посредован Т лимфоцитима. За овакав приступ користе се искуства из развоја канцерских вакцина. У случају SARS-CoV-2, у вештачке антиген-презентујуће ћелије убацује се лентивирус који носи кодирајуће секвенце структурних и протеазних протеина. Такве ћелије се затим апликују у облику вакцине субкутано. Два приступа таквим вакцинама развија компанија Shenzhen Geno‐Immune Medical Institute из Кине (NCT04299724 и NCT04276896) и Aivita Biomedical Inc. (NCT04386252).

Инактивисане вакцине се производе према најстаријој технологији, при чему се вирус инактивише формалдехидом, гама или ултравиолентним зрачењем. На том принципу је развијен велики број вакцина против SARS-CoV-2 које су у фази клиничких тестирања. И за ове вакцине је неоходан адјуванс (алуминијум или CpG нуклеотиди). Неке од њих су вакцине Sinovac Biotech (NCT04352608) у којој је SARS-CoV-2 инактивисан бета‐пропиолактоном, Sinopharm из Вухана (ChiCTR2000031809), Bharat Biotech (Индија) и неке вакцине из Бразила, Шкотске и Индонезије. Избор инактивирајућег средства је од кључног значаја за спречавање нежељених ефеката а који су забележени код неких вакцина примењених на овај начин према MERS–CoV.

Примена живих вакцина такође припада најстаријем виду вакцинације. У стратегији креирања живих вакцина против SARS-CoV-2 користи се живе атенуисане вакцине, које најближе подсећају на природну инфекцију и по правилу су имуногене и без адјуванса. Codagenix and Serum Institute of India развијају живу атенуисану SARS-CoV-2 вакцину, користећи посебну технологију где се у RNК вируса уграђују секвенце нуклеотида (CpG и UpA) које појачавају имунски одговор.

Када су у питању векторске вакцине, гени који носе шифру за синтезу протеина вируса убацују се у други микроорганизам (вирус или бактерију). Од вирусних вектора најпогоднији су аденовируси, вирус везикуларног стоматитиса (VSV) и модификовани вирус вакциниа (engl. vacciniavirus) Анкара (MVA). Ови вектори или немају способност умножавања (репликације) или се вектор умножава у ћелијама. Избор вектора умногоме утиче на имуногеност вируса. До сада је синтетисано пет не-реплицирајућих векторских вакцина против SARS-CoV-2 и све се базирају на аденовирусу као вектору. Једна од њих је Оксфордска АZD1222 вакцина. Из резултата прве фазе клиничких студија показана је одлична имуногеност како на нивоу хуморалног тако и ћелијског имунитета, а нежељене локалне и системске реакције су биле благе. У сарадњи са Astra Zeneca, вакцина се тестира у Великој Британији (NCTO4444674), Бразилу (ISRCTN89951424) и САД (NCTO4516746) у оквиру фазе II/III клиничких студија. Cansino Biologics (Кина) (ChiCTR2000030906) развија сличну вакцину где је вектор аденовирус 5. Досадашњи резултати су показали добар ћелијски и хуморални одговор и благе нежељене системске реакције. Вакцина се испитује и у Канади (NCTO4398147) у оквиру друге фазе. Компанија Janssen производи вакцину на специфично модификованом не-реплицирајућем аденовирусном вектору користећи искуства из развоја вакцине против вируса еболе и зика. Вакцина је у првој фази клиничке студије у САД, Белгији (NCTO4436276) и Јапану (NCTO4509947). Једна од векторских вакцина из ове групе је и руска вакцина Спутник В која је базирана на коришћењу два аденовирусна вектора. Испитује се у растворном (NCTO4436471) или лиофилозованом облику (NCTO 4437875). Трећа фаза је регистрована у септембру 2020. године (NCTO4530396). Досадашњи резултати су показали високу имуногеност уз присуство блажих нежељених локалних и системских реакција. У серуму вакцинисаних особа детектована су и антитела према аденовирусима из вакцине.

Merck је у сарадњи са Институтом „Луј Пастер” (NCTO4497298) и Универзитетом у Питсбургу (NCTO 4498247) развио вакцину против SARS-CoV-2 која се заснива на вирусним векторима (модификован вирус малих богиња) који се репликују. Досадашњи резултати показују да је вакцина ефикасна и безбедна. Неке вакцине из ове групе  примењују се преко слузокоже носа или путем дигестивног тракта коришћењем пробиотика.

Вакцине засноване на нуклеинским киселинама

Вакцине засноване на нуклеинским киселинама се издвајају зато што у условима ове пандемије могу да се масовно производе за кратко време, истовремено и из више центара и што је њихова производња јефтинија у односу на друге вирусне вакцине. Ове вакцине користе DNK или RNK плазмиде у којима је уграђен ген од интереса. Против SARS-CoV-2 је развијено шест платформи за RNК и четири платформе за DNК вакцине које се тренутно налазе у фази клиничког тестирања.

DNK вакцине се производе коришћењем плазмида прокариота у које је уграђена DNK секвенца за одређени протеин SARS-CoV-2 . Овако конструисаним плазмидом врши се трансфекција у Е. coli заједно са експресионом касетом која омогућава експресију трансгена у хуманим ћелијама. Експресиона касета садржи кључан узводни промотор који управља експресијом трансгена, тзв. Козак секвенцу, инсертован трансген и 3’полиаденилацијски реп (PoluA). Након примене, DNК вакцину преузимају ћелије домаћина на месту имунизације или мигрирајуће антиген-презентујуће ћелије. Да би се изазвао адаптивни имунски одговор, DNK мора да уђе у једро ћелије. На путу проласка кроз цитоплазму DNK активира интрацелуларне рецепторе који стимулишу неспецфичан имунски одговор. Он је битан за развој специфичног имунског одговора на протеин вируса који ће бити синтетисан у ћелији из информације уметнуте у DNK трансген комплекс. Покретање урођене имуности од суштинског је значаја за стимулацију адаптивне имуности DNK вакцина. Пролаз убризгане DNK до нуклеуса је изузетно неефикасан, пошто велика количина DNK не успе да прође ћелијску мембрану или омотач једра. Како би се ублажио овај губитак, DNK вакцине користе посебне платформе за апликацију каква је електропорација и генски пиштољ.

DNK вакцине против SARS-CoV-2 развијене су на платформама које су проистекле из истраживања на другим SARS вирусима. У овом контексту, Inovio  производи вакцину под називом INO‐4800 (NCTO4336410). У претклинчким студијама забележена су неутралишућа антитела и активација специфичних Т ћелија код експерименталних животиња. Генексин (Genexine) из Јужне Кореје (NCTO4445389), Зидас Кадила (Zydus Cadila) из Индије (CTRI/2020/07/026352) и Универзитет Осака из Јапана (NCTO4463472) су започели прву фазу клиничког тестирања DNK вакцина против SARS-CoV-2 .

RNK вакцине се базирају на истом принципу као и DNK вакцине тј. експресије вакциналог трансгена, који у молекулу RNK носи шифру за синтезу вирусног антигена у ћелији домаћина. За разлику од DNK вакцина, експресија RNK вакцина почиње онда када удје у цитосол ћелије, чиме се повећава ефикасност експресије. RNK вакцина такође стимулише неспецифични имунитет обзиром да вирусне RNK препозају рецептори урођене имуности унутар цитоплазме. То некада може имати и нежељени ефекат јер рана синтеза интерферона типа 1 може да инхибира експресију протеина. Због тога се у том циљу у RNК убацују нуклеотидне секвенце које блокирају синтезу интерферона али тако да у потпуности не спрече неспецифични имунски одговор. Постоје две примарне врсте RNК вакцина: информациона RNK (iRNK) и самоамплификујућа RNK (saRNK). Нерепликујуће iRNK вакцине су конструкти направљени да кодирају антиген од интереса и обично имају тзв. 5’капу, UTR регионе, који се не преписују, и poli А rep. 5’капа је неопходна како би се и RNK повезала са еукариотским транслационим комплексом. UTR се бирају како би се оптимизовала експресија RNK протеина а тиме и избегла уградња секвенци које би кочиле транслацију, односно нeпреписивање информације садржане у iRNK у вирусни протеин. iRNK вакцине су конструкти који су направљени коришћењем RNK полимераза порекла из бактериофага и секвенци за транскрипцију DNK на калупу RNK.

Самоамплификујуће RNK вакцине су RNK репликони базирани на геному алфа вируса који су модификовани да кодирају антиген од интереса уместо RNK структурних протеина. Вирусни репликон такође садржи отворени оквир читања (ORF) који кодира четири неструктурна протеина вируса алфа  (nsP1-4) и субгеномски промотор. Неструктурни протеини формирају RNK-зависну RNK полимеразу (RDRP). RDRP комплекс преписује додатне копије вакцине у трансфектованој ћелији. Резултат овога је да самоамплификујућа RNK вакцина индукује синтезу протеина који перзистира дуже него протеини који се преписују са нерепликујућег RNK.

RNK вакцине против SARS-CoV-2 су развијене на платформи вакцина SARS-CoV-1 . У току су тестирања шест таквих вакцина. Прву од њих је почела да развија компанија Модерна (NCTO4283461). У првој фази испитивања на 45 добровољаца, који су примили различите дозе, показана је висока имуногеност, али су код највеће дозе (250 µг) забележени и изразитији нежељени ефекти. Вакцина која је сада у другој фази (NCTO4405076) и трећој фази (NCTO4470427) тестирања, садржи дозу од 100‐µг.

Бионтек (BioNTech) у сарадњи са Фајзером (Pfizer) развија четири кандидата за вакцину засновану на RNK платформи. У питању је iRNA која носи информацију за S протеин, а која је модификована нуклеозидом. Прва и друга фаза клиничког тестирања спроводи се у Немачкој (NCTO4380701) и САД (NCTO4368728), док је испланирано да се трећа фаза спроведе на више места. Од септембра, када је направљен овај пресек, вакцина је већ регистрована у В. Британији, САД и неким другим земљама. Досадашња истраживања су показала развој хуморалног и ћелијског имунског одговора. Компанија CureVac и Народноослободилачка војска (Кина) су такође развили iRNK вакцине које су у фази клиничких тестирања, али до момента писања овог рада нису објављени резултати.

Империјални колеџ у Лондону у сарадњи са компанијом VacEquity Global Health  развија саморепликујућу RNK вакцину која кодира протеин S. Тестирање вакцине на људима, у којима је учествовало 420 добровољаца, започело је у јуну 2020. године (ISRCTN17072692). Арктурус (Arcturus) са седиштем у Сингапуру развија саморепликујућу RNK вакцину, која такође кодира S протеин, налази се у првој фази клиничког тестирања (NCTO4480957).

Разлози за и против различитих платформи

Значајно питање је како проценити која је вакцина најефикаснија и најбезбеднија имајући у виду тако велики број платформи за њихов развој. Већи број вакцина против SARS-CoV-2 које су у развоју, односно у завршној фази клиничких испитивања, засноване су на истраживањима вакцина против других вируса, укључујући и породицу SARS, а које до сада, због малих потреба и недовољних финасијских средстава, нису завршене. Свака пределожена вакцина има своје предности и мане. Вакцине са живим атенуисаним вирусима имају дугачку историју безбедности и ефикасности, али можда нису погодне за масовну производњу у тренутној пандемији због дужине времена потребног да се направи атенуација. Инактивисане вакцине такође имају дугачку историју ефикасности и њихова предност је што се брзо производе. Међутим, неопходна су посебна безбедна изолована постројења за производњу већих залиха вируса. Уз то, постоји и бојазност око појава имунопатолошких манифестација изазваних инактивисаном вакцином, која је примећена код неких других респираторних вируса и у претклиничким моделима вакцина против SARS-CoV-2. Вакцине са рекомбинантним протеинима користе се од осамдесетих година прошлог века. Оваквим вакцинама се стимулише специфичан имунски одговор специфично на најимуногенији протеин вируса али се може изгубити шири обим заштите када дође до озбиљнијих мутација у генима вируса који такве протеине кодирају. Са оваквим протеинским вакцинама спорије се започињу клиничка тестирањa али, ако се покаже ефикасност, имају бржу могућност  лиценцирања. Један од изазова јесте избор праве конформације протеина. S протеин је метастабилан и мање протективан ако се користи у структурном облику непосредно након фузије. Једина пептидна вакцина из Института „Вектор” у Колцову, у Русији, регистрована је за клиничко тестирање (NCTO4527575)  и код ње се користи алуминијум као адјуванс.

Приступи базирани на антиген презентујућим ћелијама нису практични за широку производњу. Са друге стране, DNK и RNК вакцине имају пуно потенцијала у смислу брзине имунског одговора брзог прилагођавања масовној производњи, што се посебно показало значајним у овој епидемији.  DNK вакцине су кроз историју биле мање имугене него вакцине засноване на другим платформама. RNК вакцине нису до сада биле тестиране за инфективне болести и ово је први пут да је једна самоамплификујућа вакцина коришћена за ове намене. RNК може имати проблем у погледу температурне стабилности пошто захтева складиштење на ˗80˚Ц. Вирусне векторске вакцине стигле су најдаље у клиничком испитивању, пошто су чак три кандидата у касној фази клиничких тестирања. Познато је да су безбедне, али могу изазвати нежељене реакције у већим дозама. Једно од питања је већ постојећи имунитет против вектора, посебно када се користи вектор AD5. Зато ће се са великом пажњом пратити која ће платформа и кандидати бити најефикаснији и најбезбеднији.

До краја септембрa 2020. године, многе компаније, које су развиле вакцине против SARS-CoV-2, за потенцијалну примену нису објавиле податке о завршеним тестирањима. Међутим, оно што је до сада објављено указује на то да су вакцине безбедне, али да се нежељене појаве појављују при већим дозама, што су саопштиле Модерна, Кансино, Оксфорд и Бионтек за своје вакцине након прве фазе клиничких испитивања. Ти подаци су били важни да се у наредним фазама доза смањи. За све ове вакцине показано је да су имуногене али је упоредна процена овог параметра отежана због неуједначених методологија за процену имунског одговора у вакцинисаних особа. Оно што даље компликује поређење јесте и објављивање података у форми саопштења за штампу и друге медије уместо публикације резултата у рецензираним часописима. И на крају многе компаније не саопштавају податке о ефикасности тестирања на основу рандомизириног узорка. Такође се ефективност другачије процењује, неки користе параметре смањења обољевања а други смањења броја потврђених случајева…

Интегралну верзију текста можете видети овде.